31 enero, 2010

REACTIVOS MICRO QUIMICOS MAS USADOS PARA EL ESTUDIO DE LOS HONGOS




Rehidratación del material de herbario

Cuando se trabajo o investiga con material desecado o de herbario, es necesario prehidratarlo, para que vuelva a las condiciones que tenían al ser recogidos.

Un buen procedimiento consiste en coger todo el carpóforo, si este es pequeño, o una parte del mismo: pie o láminas que decidamos estudiar, bien en vidrio de reloj o un vaso pequeño de precipitación o en una placa Petri pequeña, con etanol en solución acuso de 70-90º o menos durante 30 segundos, y a continuación pasarlo a otro vidrio de reloj o vaso de precipitación solamente con agu8a, con el cual podemos realizar las operaciones de deseamos debido a que, una vez prehidratado el material puede ser estudiado como recién recogido del campo. También puede prehidratarse, con óptimos resultados, aplicando en vez de Etanol, soluciones alcalinas de hidróxido sódico o de potasio, variando sus concentraciones entre el 5-10%.

De igual modo e interesante, la técnica que denominamos “salivazo”, consistente en humedecer la parte a estudiar del hongo, aplicándole saliva con el dedo, y al cabo de 10-15 segundos raspar bajo una lupa la zona de estudio, que se desprenderá fácilmente y sin romperse demasiado, envolverla en rojo congo amoniacal o soluciones alcalinas. Esta técnica es aconsejable para el estudio de cutículas, himenio y tramas de Aphyllophorales resupinados.

Por otro lado, para anular las posibles burbujas de aire que podrían quedar entre el porta y cubre objetos, podemos mesturar con solución acuosa de etanol o 50-95 % con floxina. Cuando se trabaja con material fresco emplease Teepol, para impedir que el aire se acumule en las secciones de la muestra de estudio. El Teepol es un detergente del tipo Gardinol. Ambos están compuestos por una mezcla de sales sódicas de alcoholes grasos, esterificados con ácido sulfúrico. Suministrado por la casa FLUCKA.

Indicaremos a continuación diferentes reactivos por orden alfabético, su composición química y usos en el estudio de los hongos; muchos de ellos son tóxicos o corrosivos y deben de manejarse con mucha prudencia, otros deben guardarse en frascos de topacio, y renovarse en espacios cortos de tiempo ya que se deterioran o modifican sus composiciones, bien por oxidación o por otras causas.


RELACION DE REACTIVOS.


Acetocarmin:

Emplease para observar los basidios de ciertos Agaricales, sobre todo en las especies de los géneros Lyophyllum, Tephrocybe y Calocybe que, con este reactivo se vuelven de color púrpura negruzco o violeta negruzco. Esta reacción se denomina siderófila o carminófila.

Mencionaremos dos fórmulas empleadas en la actualidad:

Fórmula 1. GROUND & MARR (1965)

a) Acido acético glacial y una solución acuosa saturada de carmín, que se prepara añadiendo agua y un exceso de carmín, dejándole reposar y filtrándolo después.

b) Emplear bien A o B.

A) 5% de solución acuosa de cloruro férrico (% g. FeCl3, 6 H2O en 95 cc. H2O).
B) 3% de solución acuosa de sulfato férrico amónico.
Añadir a A o B con 3 g. de sulfato amónico 1 ml. de ácido acético glacial, 0,1 ml. de ácido sulfúrico concentrado. Diluir esta mestura en 100 ml. de agua destilada.

Fórmula 2, HENDERSON, ORTON & WATLING (1969)

Preparar ácido acético al 45% (45 cc. de ácido acético glacial en 55 cc. de agua y etanol al 45% (45 cc. de etanol con 55 de agua destilada) Hervir el ácido acético con exceso de carmín durante ½ hora, filtrar y diluir con etanol, añadir 2-4 gotas de hidróxido férrico.

Si optamos en utilizar esta segunda fórmula, colocaremos un pequeño trozo de lámina a estudiar unas gotas de reactivo antes indicado, en un vidrio de reloj, calentando este directamente a llama. Cuando el líquido emita vapores muévase un fragmento y se le añadirá nuevas gotas de reactivo. Esta operación repítase dos o tres veces.


Acido clorhídrico:

Emplease su solución concentrada debiendo tener cuenta que este reactivo es muy corrosivo.

Débese colocar en el material de estudio unas gotas de reactivo, aplicase por ejemplo, en el estudio del velo universal formado por esferocistos de ciertas especies del género Coprinus., para diferenciar una verdadera ornamentación o que se presente en la pared del esferocisto o en una secreción cristalina, ya que en este caso se disuelve en dicho reactivo.


Acido sulfúrico:

Emplease el acido concentrado tal como se presenta en el comercio, por lo que se deben extremar las precauciones por ser una ácido fuertemente corrosivo.

Utilizase por ejemplo, entre otros, en el género Coprinus, hinchándose en este reactivo o saco perispórico presente en algunas especies, siendo un dato taxonómico de suma importancia.

Azul algodón:

Indicaremos la técnica de HENDERSON, ORTON & WATLING (1969): mezclasen 50 ml. de una solución acuosa el 1% de azul algodón (1 ml. de azul algodón en 99 de agua) con otra de acido láctico 100 g., fenol 100 g., glicerina 150 ml. y 50 ml. de agua Algunos micólogos para preparar la solución al 1% de azul algodón, lo realizan añadiendo 1 g. de azul algodón en 99 cc. de ácido láctico.

Utilizase para contrastar la reacción cianófila, es decir, la coloración azulada que toman las paredes esporales de algunos taxones, que además posibilita una buena observación de la misma; por otra parte, también se emplea en el estudio de ciertos crisocistidios que absorben fuertemente el color azul.



Azul de cresilo:


Disolver 0,5-1 g. de azul de cresilo en 99-99,5 ml. de agua. . Agitase y dejar en reposo 5-10 minutos y, a continuación, se filtra.

Ciertas esporas y paredes hifales se vuelven de color rojizo o violeta rojizo al contacto con este reactivo, denominándose reacción meta cromática. Es característica de las esporas del género Macrolepiota, las hifas del pie de ciertas especies del género Mycena, de ciertos gleocistidios de Corticiaceae, de las paredes de los cistidios del género Melanoluca, de los basidios del género Tricholoma y de la trama de algunas especies del género Agrocybe


Azul de metileno:



Se disuelve 1 g. de azul de metileno en 99 cc. de agua .

Tien las mismas aplicaciones que el azul de cresilo. Algunos micólogos prefieren el azul de cresilo para obtener mejores resoluciones.



Azul de Poirrier:


Denominase también azul de anilina o azul de metilo, es una sal de sodio soluble en agua, que se presenta en el comercio como un polvo azul oscuro, y corresponde al trifenil-p-rosalina-trisulfonato sódico y entre otras aplicaciones para teñir el colágeno

Azul de toluidina:


Solución acuosa al 1%. Utilizase igual que el azul de metileno.




Clorovainillina:


Indicamos la fórmula de SINGER (1975) que consiste en:

Disolver 5 mg. De cristales de vainillina en 20 cc. de agua y 4 cc. de ácido clorhídrico (utilizase una solución CIH al 65%). Debido a su inestabilidad este reactivo es de preparación extemporánea.

Utilizase para ver el contenido de los macrocistidios, pseudocistidios y algunas hifas oleíferas, y es muy necesario en el estudio del género Russula. Algunos micólogos lo sustituyen por sulfobenzaldehído, sulfovainillina o sulfoformol.



Eritrosina:


Según PALMER (1955) utilizase la solución de eritrosina A en amoníaco concentrado.

Emplease para teñir el protoplasma de los elementos himeniales.


Etanol:


Solución alcohólica al 70%.

Disuélvese en cc. de alcohol de 90º 3 cc. de agua.



Fuchsina:

Disuélvese fuchsina en una solución de ácido clorhídrico al 10.

Colocase el material a estudiar en fuchsina durante 15 minutos y lavase con solución acuosa de ácido clorhídrico al 10% durante 1 minuto, lavase a continuación con agua y montase la preparación en agua.

Utilizase para distinguir ciertos tipos de hifas y gránulos en los macrocistidios de ciertas especies de género Russula, que reaccionan tomando una coloración rojiza púrpura.


Guaico (tintura de):

Preparase una solución saturada de resina de guaiaco en etanol al 70%.

Utilizase para estudiar ciertas reacciones que se producen en el cuerpo de ciertos géneros de Agaricales.




Hidróxido de amonio:


Solución acuosa 3-10%.

Utilizase con gran frecuencia en micología sobre todo para recuperar el tamaño y forma original del material desecado. Sin embargo puede alterar la coloración esporal, las esporas de la familia Bolbitiaceae se oscurecen frecuentemente. Emplease en la observación de placa hilar de espora de género Galerina, añadiendo una solución de amoníaco y posteriormente lavando y cubriendo en solución al 50% de hidrato de cloral. También se usa en el estudio de los crisocistidios de los géneros Stropharia, Hipholoma y Pholiota, y las hifas incrustadas de ciertos Agaricales, y por último mencionaremos el cambio de color que presentan los pleuro y caulicistidios del género Xeromphalina, que toman una coloración marrón.

Los micólogos europeos prefieren utilizar este reactivo y, los americanos, hidróxido potásico, este último tiene un inconveniente de dejar un residuo blancuzco al evaporarse el agua.


Hidróxido de potasio:


Solución acuosa al 3-5%.

Montase el material una solución de hidróxido de potasio al que se puede añadir rojo congo o floxina.

Utilizase con frecuencia, como hidróxido de amonio, por los micólogos para recuperar el tamaño y forma original del material desecado. Sin embargo, los europeos el hidróxido de amonio, en contraposición de los americanos. Son interesantes las reacciones específicas de los cistidios del pileo del género Crinipellis, que se vuelven grisáceos y las hifas del pileipellis de ciertas especies de Cystoderma que reaccionan tomando una coloración rojiza marrón.


Hidróxido de sodio:

Solución acuosa 3-5%.

Utilizase igual que el hidróxido de potasio.


Lugol:

Emplease su solución concentrada y diluida.

a. Lugol concentrado: preparase con 1 g. de iodo y 2 g. de ioduro potásico, disueltos
en 150 ml. de agua destilada.

b. Lugol diluido: 300 ml. de agua destilada con los mismos componentes que el
concentrado.

Solución yodada utilizada para teñir las estructuras (por ejemplo, poros) amiláceas de las ascas.

Utilizase para oscurecer el contenido de los macrocistidios, algunas hifas oleíferas y algunas hifas lactíferas. Razón por la cual que emplea específicamente en la taxonomía del género Russulas, ya que las hifas laticíferas de la familia Russulaceae se vuelven de color marrón en sulfoformol, negras en sulfobenzaldehido o de color carmín en sulfovainillina.

Puede ser sustituido por clorvainillina, sulfovainillina o sulfoformol.


Sulfoformol:

Mesturar 6 cc. de una solución acuosa al 40% de formaldehído en 3 cc. de agua destilada y 10 cc. de ácido sulfúrico concentrado. Se deberá añadir lentamente el ácido sobre agua y no el agua sobre el ácido.

La aplicación es la misma que el sulfobenzaldehído.


Rojo congo amoniacal:


Solución al 1% de rojo congo en amoníaco concentrado. Algunos micólogos prefieren soluciones al 1-2% de rojo congo en agua.

Utilizase con agua para estudiar material fresco y con amoníaco concentrado para trabajar con material de herbario.

Cuando se recupera el material desecado añádase este a una mestura constituida por una gota de rojo congo, una gota de phloxina y una gota de hidróxido de amonio o de hidróxido de potasio. Si el medio se deseca podemos añadir varias gotas de hidróxido de amonio o de potasio entre el porta y cubreobjetos para que se absorba con rapidez.

Por este método se obtienen buenos contrastes, volviéndose rojizos los elementos a estudiar. En microfotografía da igualmente excelentes resultados.



Preparaciones permanentes o semipermanentes:

Es interesante ir realizando una colección de preparaciones fijas, en las que podamos estudiar en cualquier momento los principales caracteres microscópicos de los hongos que vayamos introduciendo en nuestro herbario y que convenientemente archivados nos facilitarán so búsqueda y estudio.

Estas preparaciones pueden ordenarse por géneros y a continuación por especies, todo esto por orden alfabética o bien siguiendo un orden taxonómico. Con ambos sistemas, los localizaremos prontamente para su estudio, podemos comparar rápidamente unos taxones con otros, con evidente ahorro de tiempo y un replanteamiento expedito de los problemas taxonómicos.

Para la realización de preparaciones fijas o permanentes, aconsejamos el medio de HOYER y posteriormente recubrir el borde del cubreobjetos con Eukitt, suministrado por Vitromed-Basel, de Suiza.

Con este método se logra al cabo de un corto tiempo la rehidratación de las estructuras a estudiar. Antes de poner las preparaciones verticales se deberá esperar 24 horas.



Metol:


Reactivo usado como revelador en fotografía, o p-metil-amino-fenol.


Picroformol de Hollande:

Fórmula:

Agua destilada………………………………………………………. 100 ml.
Acetato de cobre neutro……………………………………………… 2,5 g.
Acido pícrico………………………………………………………… 4,0 g.
Formalina comercial (solución acuosa de formaldehído al 40%)…… 10 cc.
Acido acético glacial………………………………………………… 1,5 cc.

En un mortero se disuelve en frío el acetato de cobre en el agua y después se añade poco a poco, y agitando, el ácido pícrico. Una vez disuelto este, añádase el formol y el ácido acético. El reactivo se conserva indefinidamente, y aplícase según la siguiente metodología:

1. Manténgase una solución de Picroformol de Hollande, los cortes de material a estudiar durante 5 minutos.

2. Sumérjase después unas gotas de solución de hidrato de cloral y se acerca a un llama, pero nunca directamente, hasta que comience a desprender vapores, es decir, que comience la ebullición.

3. Observase a continuación al microscopio, motando en solución acusona concentrada de hidrato de cloral.

Emplease par insolubilizar pigmentos vacuolares precipitados, por ejemplo, en el subgénero Leptonia y facilitar las coloraciones posteriores (KÜHNER & ROMAGNESI, 1953).


Prueba de oxidasa:


Realizase utilizando un papel de fieltro empapado con diclorofenol indofenol o bien N, N, dimetil-p-finilendiaminad. Estos colorantes son incoloros en estado reducido pero se oxidan rápidamente y pasan las formas coloreadas por las especies “oxidasa.positiva” (que contienen citocromo c), pero no por las “oxidasas-negativas (que carecen de citocromo c).



Reacción de amylon:


Utilizase en el género Boletus.

Para obtener resultados positivos seguimos las indicaciones de IMLER (MEIXNER, 1975), reacción que no se deben utilizarse con ejemplares viejos o en mal estado. Tomase un pequeño fragmento de carne del pie, en material fresco o del mismo de herbario en desecado. Añádase una gota de reactivo de Melzer, dejase actuar 3 minutos, triturase con lanceta (no se especifica sea de hierro o de acero inoxidable). Depositase sobre papel de filtro hasta que el reactivo se tenga absorbido. Añádase una gota de hidrato de cloral concentrado y secase el medio con un papel de filtro hasta que pierda el color amarillo. Añádase de nuevo hidrato de cloral y después observase al microscopio a la luz diurna (se apretará levemente el cubreobjetos. En caso de reacción positiva, las hifas aparecen de un color violeta azulado. Si reacción es más débil se colorea de azul-grisáceo, especialmente cuando el material procede de hongo fresco. En caso de reacción negativa, las hifas se ven amarillas, verdosas o pardas sin ningún tondo azul o violeta.



Reacción de Schäfer:


Utilizase en el género Agaricus. Seguimos las indicaciones de CAPELLI 1984), reacción, conocida también con el nombre de reacción en cruz, realizase preferentemente sobre la superficie del sombrero (salvo indicación contraria) con material fresco o desecado. Consiste en trazar dos líneas en cruz con dos barritas de vidrio, una de ellas bañada en anilina y la otra en ácido nítrico. En el punto de contacto (eje de la cruz) aparece una coloración con tonos anaranjados, en este caso la reacción se considera positiva, en ausencia de coloración la reacción es negativa.

La anilina debe ser pura e incolora y puede utilizarse pura o diluida con alcohol etílico una concentración al 10%.

Para obtener una anilina incolora, muy apropiada para esta reacción, destilase esta después de añadirle una pequeña cantidad de polvo de zinc (gris de zinc).

El ácido nítrico puede ser utilizado concentrado lo diluido en agua al 50%.



Reactivo de Henry:


Este reactivo designado también TI4 es de preparación delicada, pues el óxido de talio que debe utilizarse y el óxido talioso, Tl2O ya que con óxido tálico, TIO el reactivo no da buenos resultados.

Fórmula

Oxido talioso (Tl2O)…………………………………………………………........ 2,g.
Acido clorhídrico concentrado purísimo……………………………………… 4 ml.
Acido nítrico concentrado purísimo…………………………………………… 1 ml.
Cuando el óxido talioso se disuelva añadir lentamente, agitando con suavidad
Bicarbonato sódico puro………………………………………………………....... 1 g.
Y cuando remató de hervir añádase Agua destilada……………………10 ml.

Guárdese en frasco de vidrio con buen tapón esmerilado. El reactivo es muy venenoso.

Aplícase sobre la cutícula del sombrero, mediante una varita de vidrio, una o dos gotas y a guardan 1 a 2 minutos: Muy útil en muchos casos, en los Agaricus permite diferenciar el Agaricus silvicola y Agaricus arvensis del Agaricus xanthoderma. Los dos primeros dan una coloración rosada o rosa ladrillo, mientras que el Agaricus xanthoderma, no da ninguna reacción.



Reactivo de Melzer:


Disuélvese en 20 ml. de agua destilada 1,5 g. de ioduro potásico, añadiéndose después 0,5 g. de yodo y finalmente 20 g. de hidrato de cloral. Es preferible preparar la solución iodo-iodurada, que es estable, y añadir inmediatamente antes del uso el hidrato de cloral, por ejemplo: 5 g. de solución iodo-iodurada, 5 g. de hidrato de cloral. No se debe mezclar el Melzer con cualquier reactivo alcalino, ya que se produciría un fuerte precipitado.

Podemos obtener los siguientes resultados del material que se estudia con este reactivo:

1. Amiloide: aparece coloración azul, más o menos intensa, según del grado de
intensidad de reacción.

2. Dextrinoide o pseudoamiloide: reacciones tomando coloraciones marrones
hasta rojizas, según las intensidad y del color amarillento del reactivo.

Hay veces que la reacción es dudosa y debe dejarse el material no reactivo hasta un máximo de 20 minutos.



Sulfobenzaldehído:

Según SINGER (1975), disuélvese 6 cc. de benzaldehído en 3 cc. de agua destilada y 10 cc. de ácido sulfúrico concentrado. Debemos tener mucho cuidado con este reactivo al contener ácido sulfúrico concentrado, por ser un fuerte y peligroso agente corrosivo.

Es aconsejable este medio para colecciones de esporas o estructuras rígidas.



Composición de Hoyer:


Goma arábiga…………………………………………………… 30 g.
Agua destilada………………………………………………….. 50 ml.
Hidrato de cloral……………………………………………… 200 g.
Glicerina………………………………………………………….. 20 g.

Las preparaciones semipermanentes se pueden conseguir montando el material a estudiar con la siguiente composición: 1 parte de cera de abaja, dos partes de lanolina o vaselina y 4 partes de parafina.

Para esto se funde la cera de abeja en una cazo o en una capsula de porcelana añadiendo a continuación la lanolina y posteriormente la parafina. La operación debe hacerse en caliente y remover el conjunto para así conseguir un medio homogéneo.



Bibliografía:

Les réactifs mycolgiques, tomo I y II de J. Charbonel.
Groud & Marr.
Henderson, Orton & Watling.
Singer.
Palmer.
Kühner & Romagnesi.
Imler (Meixner).
Capelli.
Hoyer.

Traduccción: Alfonso Rey Pazos.
Composición: Alfonso Rey Pazos.
Fecha: 31/01/10

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